期刊名稱(chēng)：Plant Biotechnology Journal

影響因子：13.263

合作單位：海軍軍醫(yī)大學(xué)

研究部位：丹參根、莖、葉、花

研究方法：代謝組學(xué)、體外酶活、分子對(duì)接等

研究背景

2024年1月16日，海軍軍醫(yī)大學(xué)陳萬(wàn)生與張磊團(tuán)隊(duì)合作在植物學(xué)領(lǐng)域國(guó)際一流學(xué)術(shù)期刊《植物生物技術(shù)》Plant Biotechnology Journal發(fā)表一項(xiàng)最新研究成果，題為：Versatile CYP98A enzymes catalyse meta-hydroxylation reveals diversity of salvianolic acids biosynthesis。本研究以富含丹酚酸的代表性重要藥用植物丹參為研究對(duì)象，闡明了丹酚酸生物合成的多樣性，為CYP98A酶在間位羥基化反應(yīng)中催化特異性的通用性提供了新的見(jiàn)解，同時(shí)也證明CYP98A酶是利用代謝工程策略提高丹酚酸含量的理想操作靶點(diǎn)。中藥丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，是我國(guó)常用中藥。丹參藥用歷史悠久，始載于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛疲止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效。丹參作為復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參片、丹紅注射液等藥物的原料，廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病的治療，丹參藥材的年使用量超萬(wàn)噸，屬于大宗常用中藥材。丹參有效成分主要包括脂溶性的丹參酮類(lèi)化合物和水溶性的丹酚酸類(lèi)化合物。

實(shí)驗(yàn)材料

本研究中使用的是具有穩(wěn)定的RA和SAB含量的S.?miltiorrhiza f.alba，由中國(guó)科學(xué)院植物研究所贈(zèng)送。

物質(zhì)簡(jiǎn)稱(chēng)

丹參酸（SA）、迷迭香酸（RA）、丹參素（DSS）和丹酚酸B（SAB）；迷迭香酸合酶（RAS）

研究結(jié)果

1.代謝組分析——驗(yàn)證唇形科和紫草科植物SA生物合成途徑的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

丹參中酪氨酸衍生的途徑從未被報(bào)道過(guò)，丹參素（DSS）是否參與SA生物合成仍然未知。SA的生物合成可能是多樣化的，作者在同位素標(biāo)記的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證這一結(jié)論。含有同位素標(biāo)記的 L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸浸潤(rùn)3個(gè)月大的丹參葉子中。從不同時(shí)間點(diǎn)收集的葉片中提取SA，并使用UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在p-CA、CA、4-HPL、DSS、SAB和RA及其前體（包括4C-4′-HPL、4C-3′、4′-DHPL和Ca-4′-HPL）均被檢測(cè)出標(biāo)記（圖1b）。這些結(jié)果驗(yàn)證了作者的推測(cè)，即不同的?；w，包括4C-CoA和CA-CoA以及含有4-HPL和DSS的?；荏w參與SA的形成。SA的生物合成途徑是多種多樣的。

2.基因分析——SmCYP98A酶在丹參中的特性

從SmCYP98A亞家族中鑒定出4種酶，分別是SmCYP98A75、SmCYP98A76、SmCYP98A77和SmCYP98A14。SmCYP98A家族酶能催化羥基肉桂酸酯的間羥基化形成RA，說(shuō)明它們屬于4-香豆酰酯3-羥化酶（C3H）家族。通過(guò)鄰連接樹(shù)（NJ樹(shù)）分析，SmCYP98A酶與C3H之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖2a）。結(jié)果表明，SmCYP98A75與SmCYP98A14和CbCYP98A14具有更顯著的序列同源性。而SmCYP98A77與其他CYP98A成員同源性較低。四種SmCYP98A 酶的氨基酸序列包含 P450 單加氧酶的幾個(gè)特征基序，例如 PERF 基序、血紅素結(jié)合半胱氨酸基序和含蘇氨酸的結(jié)合口袋（圖2b）。

為了分析4種SmCYP98A酶在丹參中的表達(dá)譜，收集了來(lái)自不同器官的組織，包括根、莖、葉和花。結(jié)果表明，兩個(gè)基因均在所有器官中均有表達(dá)，且SmCYP98A75在花和葉中的表達(dá)水平較高，SmCYP98A76的在莖中表達(dá)較高，SmCYP98A7在花和葉中含量高，SmCYP98A14在根含量高（圖2c）。SA主要在葉和根中積累，SmCYP98A酶在這兩個(gè)器官中的高表達(dá)水平表明它們可能參與SA的生物合成。

3.體外酶活實(shí)驗(yàn)——SmRAS催化RA形成的前體

在富含SA的植株中測(cè)定了4C-4′-HPL、4C-3′-DHPL和Ca-4′-HPL等幾種?；w和受體及其酯形成產(chǎn)物，表明RAS可能在RA及其前體的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，作者接下來(lái)驗(yàn)證SmRAS在催化不同?；w和受體中的催化活性功能。體外異源表達(dá)SmRAS蛋白，并與酰基輔酶 A 供體（4C-CoA 和 Ca-CoA）和?；荏w底物（4-HPL 和 DSS）一起孵育，這些底物存在于丹參的迷迭香酸生物合成中。采用UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)反應(yīng)混合物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，SmRAS與4-HPL和DSS催化4C-CoA和Ca-CoA，形成4C-4′-HPL、4C-3′、4′-DHPL、Ca-4′-HPL和RA（圖3a、d）。

4.體外酶活實(shí)驗(yàn)——SmCYP98A75和SmCYP98A14參與RA的生物合成

將SmCYP98A75、Sm CYP98A76、Sm CYP98A77 和 SmCYP98A14共轉(zhuǎn)化到酵母中，對(duì)4C-4′-HPL、4C-3′，4′-DHPL和Ca-4′-HPL三種底物進(jìn)行表征試驗(yàn)。使用UPLC-Q-TOF/MS分析產(chǎn)物。結(jié)果表明，SmCYP98A75可以將4C-4′-HPL轉(zhuǎn)化為4C-3′，4′-DHPL和Ca-4′-HPL轉(zhuǎn)化為RA，表明SmCYP98A75催化了酰基受體衍生酚環(huán)的C-3′羥基化。SmCYP98A14可以催化4C-4′-HPL為Ca-4′-HPL，4C-3′，4′-DHPL為RA，然而，它不能直接將4C-4′-HPL轉(zhuǎn)化為RA，表明SmCYP98A14催化酰基供體芳香環(huán)的C-3羥基化。此外，當(dāng)反應(yīng)體系中存在SmCYP98A75和Sm CYP98A14時(shí)，4C-4′-HPL 被催化為RA，表明Sm CYP98A75和SmCYP98A14參與RA的生物合成（圖 3b、e）。此外，SmCYP98A76和SmCYP98A77在上述催化反應(yīng)中缺乏活性。

5.體外酶活實(shí)驗(yàn)——CYP98A75參與DSS的生物合成

上述研究表明SmCYP98A75負(fù)責(zé)RA生物合成中?；荏w部分的 C-3′羥基化，因此作者推測(cè)SmCYP98A 酶可能在丹參素DSS形成中發(fā)揮重要作用。體外酶活實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)SmCYP98A75或SmCYP98A14與4-HPL一起孵育時(shí)，在產(chǎn)物中檢測(cè)到4-HPPA，說(shuō)明這兩種酶表現(xiàn)出將4-HPL的側(cè)鏈羥基直接氧化為酮的能力。然而，在兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中均未檢測(cè)到DSS。作者認(rèn)為植物內(nèi)部生物合成環(huán)境是復(fù)雜的，包括許多代謝途徑和催化酶，在反應(yīng)體系中加入?；w和SmRAS，以模擬丹參的DSS生物合成。與SmRAS和4C-CoA或Ca-CoA孵育后，僅在SmCYP98A75催化的反應(yīng)中產(chǎn)生DSS（圖3c，f）。

6.轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)——SmCYP98A75和SmCYP98A14在丹參中的體內(nèi)功能

為了進(jìn)一步研究SmCYP98A75和SmCYP98A14在SA生物合成中的作用，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了SmCYP98A75和SmCYP98A14單突變體和雙突變體。純合突變體用于分析SA積累（圖4a，b）。與WT相比，突變體顯示出更低的SA積累。SmCYP98A75 和SmCYP98A14 突變體的DSS、RA和SAB水平降低，尤其是SmCYP98A75突變體中幾乎檢測(cè)不到DSS。與WT相比，雙突變體中DSS和RA幾乎檢測(cè)不到，表明CYP98A成員在SA生物合成中都起著重要作用（圖4c-e）。進(jìn)一步檢測(cè)SA生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，包括SmPAL、SmC4H、Sm4CL、SmTAT、SmHPPR和SmRAS在突變體毛根中的表達(dá)。結(jié)果表明，與WT相比，SmCYP98A75 和SmCYP98A14單突變系和雙突變系中SmPAL、SmC4H、SmTAT和SmRAS 的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。

進(jìn)一步超量表達(dá)SmCYP98A7 或SmCYP98A14基因。過(guò)表達(dá)材料表現(xiàn)出更高的SA、DSS、RA和SAB積累，表明這些酶可能參與了增加SA含量的代謝調(diào)節(jié)（圖4f，g）。RT-qPCR驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)材料中SmCYP98A75、SmCYP98A14和SA生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與WT相比，SmCYP98A75 和SmCYP98A14過(guò)表達(dá)材料中SmPAL、SmC4H、SmTAT 和SmRAS的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。

7.亞細(xì)胞定位分析——SmCYP98A75和SmCYP98A14的亞細(xì)胞定位

為研究SmCYP98A75和SmCYP98A14在亞細(xì)胞水平上的定位模式，構(gòu)建了SmCYP98A75-GFP和SmCYP98A14-GFP融合蛋白，并在本式煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明，在細(xì)胞膜和線粒體中觀察到SmCYP98A75-GFP和SmCYP98A14-GFP融合蛋白的熒光信號(hào)，與CYP蛋白定位特征一致。此外，CbCYP98A14-GFP的定位模式與兩種SmCYP98A酶一致。

8.基因結(jié)構(gòu)與基因?qū)臃治觥猄mCYP98A75和SmCYP98A14中的結(jié)構(gòu)識(shí)別

SmCYP98A75和SmCYP9814底物特異性的差異為研究底物識(shí)別和代謝的結(jié)構(gòu)特征提供了機(jī)會(huì)。使用在線SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模。SmCYP98A75和SmCYP98A14的整體結(jié)構(gòu)模型高度相似，表明兩種SmCYP98A的底物識(shí)別和代謝是保守的。SmCYP98A75的整體結(jié)構(gòu)模型包含22個(gè)α螺旋和8個(gè)β鏈，SmCYP98A14的整體結(jié)構(gòu)模型包含20個(gè)α螺旋和6個(gè)β鏈，與 SmCYP98A14 高度相似（圖5a）。在結(jié)構(gòu)模型中觀察到血紅素分子與兩個(gè) SmCYP98A 的活性結(jié)合口袋。通過(guò)與口袋內(nèi)殘基的多次相互作用，它被穩(wěn)定在正確的位置。兩種SmCYP98A和CbCYP98A14的血紅素包圍基序和關(guān)鍵催化氨基酸是高度保守的（圖5b）?；谂c已知 P450 的疊加，通道 1 可能容納底物進(jìn)入和產(chǎn)物，而通道 2 可能使血紅素能夠進(jìn)入水和質(zhì)子。

SmCYP98A75和SmCYP98A14分別催化RA芳環(huán)的 C-3′和C-3羥基化。此外，DSS僅在SmCYP98A75的反應(yīng)體系中檢測(cè)到，而在SmCYP98A14的反應(yīng)體系中未檢測(cè)到。為了探究?jī)煞NSmCYP98A選擇性的潛在分子機(jī)制，進(jìn)行了分子對(duì)接。觀察到Ca-4′-HPL分子與SmCYP98A75的活性口袋結(jié)合。通過(guò)與口袋中的關(guān)鍵殘基 His391、Glu224、Trp113 和 Ala300 的多次相互作用，將其穩(wěn)定在正確的位置（圖 5c）。SmCYP98A14活性口袋與4C-3′，4′-DHPL 分子結(jié)合，并通過(guò)與口袋中殘基 Asp301、Thr302、Ala297、Ser100 和 Lys103 的多次相互作用穩(wěn)定（圖 5d）。在CYP的多序列比對(duì)中，具有關(guān)鍵殘基的區(qū)域高度保守，這反過(guò)來(lái)表明這些區(qū)域與底物識(shí)別相關(guān)（圖5e）。此外，Glu224（Sm CYP98A75）、Ser100 和 Lys103（SmCYP98A14）定位的兩個(gè)關(guān)鍵基序被鑒定為底物選擇和結(jié)合區(qū)域（SbC4H1 中的F/G 環(huán)）。SmCYP98A14和CbCYP98A14中兩個(gè)關(guān)鍵基序的殘基幾乎相似，這表明這兩種蛋白質(zhì)可能具有相同的底物選擇偏好（圖 5e）。與殘基Thr301、Ala 297、Trp113、Ala101等多次相互作用，穩(wěn)定了SmCYP98A14活性口袋中的4C-4′-HPL和4C-3′，4′-DHPL分子。

研究總結(jié)

在多種食品和醫(yī)療行業(yè)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力，這推動(dòng)了全球?qū)A一代的關(guān)注。SA的生物合成途徑已在多個(gè)物種中報(bào)道，幾乎所有研究都認(rèn)為只有一個(gè)?；w和受體參與SA的形成。本研究研究強(qiáng)調(diào)，各種?；w和受體參與酯形成反應(yīng)，CYP98A酶負(fù)責(zé)SA生物合成中的不同間羥基化。在這里，以S. miltiorrhiza為例，闡明SA生物合成的多樣性（圖6）。這些研究大大加深了對(duì)酚酸生物合成途徑中SA的理解，并增強(qiáng)了我們克服具有多種藥理活性的工程復(fù)合SA的合成生物學(xué)挑戰(zhàn)的能力。